螢光顯微術結合了基因轉殖螢光蛋白以及外源性螢光染料,一直是生物及材料研
究中最常用的成像技術。這主要是因為其有精確的標定性,例如可以透過基因技
術標定特定的神經元,除此之外,螢光的無背景光學檢測提供了極高的敏感性。
然而,許多分子是不會發出螢光的,故在進行觀測時常常需要透過基因轉殖或染
色技術才能進行成像。螢光的標記會對樣本造成干擾,尤其是對於生物體內的小
分子,例如 DNA、RNA、蛋白質等,這容易造成生物系統的干擾,即便檢測出
結果,也無法得知其原生的功能狀態。此外,螢光具有光漂白的問題,即在長時
間或高強度的雷射照射下,螢光訊號會逐漸減弱,不利於長期觀測。在本技術
中,我們提出利用同調拉曼散射技術提供影像對比,追求無需標定即可觀察到神
經反應與生物體內的分子動態,以增進我們對大腦複雜運作原理之理解,也可望
解決傳統螢光之光漂白問題。同調拉曼顯微術可用於觀測化學分子內的拉曼訊號
特徵,結合高靈敏度、三維空間解析度和分子鑑別能力,成為生物研究的重要工
具。拉曼訊號的產生需要兩道中心波長相異的短脈衝雷射光在時間和空間上高度
重合且兩道光的頻率差必須滿足目標分子的特定拉曼位移。為了滿足不同樣品的
不同拉曼位移(生物樣本通常分佈在300-1800 cm-1和2800-3500 cm-1之
間),同調拉曼檢測光源通常包括一台固定中心波長的短脈衝雷射,並配合一台
可調波長的短脈衝雷射。傳統上,光源使用光參數振盪器(OPO)或光參數放大
器(OPA)。然而,OPO/OPA系統存在一些問題,包括受制於相位相依問題而難
以實現兩道光之間的最小頻率差小於1000 cm-1,進而無法觀測特定樣品,而其
系統複雜且成本高昂等問題。為了克服傳統OPO/OPA系統所面臨的問題。我們
使用單一同調超連續譜光源,並結合可調式波長過濾器或選擇性的窄頻過濾片,
以提供拉曼檢測造影技術所需的雙色脈衝。此光源有助於增強和提升多方面的同
調拉曼效能: (一)超連續譜光源可以完整涵蓋拉曼活性區域,超過OPO/OPA光源
的範圍,有助於觀測生物體內的不同的化學分子,(二)兩道光的波長可以獨立調
整,可以引發電子預共振模式以增強拉曼訊號,提高觀測的敏感性。(三)可提供
三道以上同調光觀測多重拉曼特徵,增加分子鑑別力。此技術已成功應用於果蠅
腦的生物造影上,也已在化學溶液中驗證超過百倍的拉曼訊號提升。